ELISA實驗中必看的ELISA實驗操作要點

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酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 因其操作簡單，靈敏度高，特異性好，經(jīng)濟安全等特點而廣泛應(yīng)用，但是由于其操作步驟復(fù)雜，一般包括試劑準(zhǔn)備，樣本收集，加樣，溫育，洗滌，顯色，比色，結(jié)果判定等，其中任何一項操作不當(dāng)都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生很大影響。因此，必須加強ELISA檢測的全面質(zhì)量控制，保證其結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

1 試劑

優(yōu)質(zhì)的試劑是保證檢驗質(zhì)量的基礎(chǔ)。從4℃冰箱取出的試劑必須放置室溫20～30 min 后再啟用，否則水化層的形成可能影響試劑的原始濃度及試劑中溶質(zhì)分子的均勻分布。未用完的試劑和質(zhì)控品應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。根據(jù)蛋白質(zhì)在冷凍過程中出現(xiàn)蛋白分子分布改變的特點，試劑正式啟用前應(yīng)充分混勻。所用蒸餾水、去離子水和自行配制的緩沖液等，都必須調(diào)整其pH 值和離子強度等。不同批次的試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量一致，因此必須選擇和訂購長批號的試劑，并保證保存條件，嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免試劑批號改變而重建質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

2 標(biāo)本

患者標(biāo)本中有可能含有干擾試驗的免疫物質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素一般包括類風(fēng)濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白、異嗜性抗體及某些自身抗體等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合適的試劑；外源性干擾因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細菌污染、標(biāo)本貯存時間過長及標(biāo)本凝固等。要注意避免標(biāo)本出現(xiàn)嚴(yán)重溶血，標(biāo)本中血紅蛋白中含有血紅素基因，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA測定試驗中，容易在溫育過程中吸附于固相，從而與加入的底物反應(yīng)顯色。標(biāo)本在低溫下保存時間過長，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測定中會導(dǎo)致本底加深，甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常血清標(biāo)本可在2～8℃保存1 周，冷凍保存時間會更長。血清標(biāo)本應(yīng)充分離心，否則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融，標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價下降從而引起假陰性結(jié)果。標(biāo)本的采集及分離要注意盡量避免細菌的污染。此外，標(biāo)本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮分布不均，因此重新溶解的標(biāo)本必須混勻，但不要劇烈振蕩和反復(fù)顛倒。

3 操作因素

3.1 加樣

加樣器是一種比較精密的工具，其在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，因此必須定期對加液器進行維護和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染；加樣速度不可太快，以免將標(biāo)本加在孔壁上部，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡，加樣時還應(yīng)注意操作時差對結(jié)果的影響，尤其對競爭法檢測結(jié)果影響更大。因此建議在加酶結(jié)合物和底物時用多道加液器，或者雙人同時加樣以減少操作時差對結(jié)果的影響，另外有些項目在檢測前需要稀釋以減少非特異性反應(yīng)。稀釋的方式非常重要，最佳方式是采用振蕩器混勻，不可隨意改變混勻方式。

3.2 溫育

3.2.1溫育的溫度：育常采用的溫度有43 、37℃、室溫或4℃等。37℃是實驗室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1～2 h 產(chǎn)物的生成可達峰，為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩來增加抗原抗體接觸的概率。抗原抗體反應(yīng)在4℃更為，形成的產(chǎn)物更多、更穩(wěn)定，但因所需時間太長，在ELISA檢測中一般不予采用。

3.2.2溫育的方式：溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（即“邊緣效應(yīng)"）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，可用塑料貼封紙覆蓋板孔。若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。溫育過程中每塊反應(yīng)板不能重疊放置，防止溫度擴散的不均勻性。

3.3 洗滌

洗滌是ELISA不同于均相免疫學(xué)檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個ELISA反應(yīng)過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，卻非常關(guān)鍵。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分，包括未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌液通常為含有一定濃度Tween 20 的緩沖液，Tween 20 是一種非離子去垢劑，既含親水基團，又含疏水基團，在洗滌中的作用機制是借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白分子的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白分子與固相的吸附。同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下，促進蛋白質(zhì)分子脫離固相而進入液相，最終被洗脫。必須注意非離子去垢劑的使用濃度，常用的洗滌液是含0.05 %Tween20，pH為中性的磷酸鹽緩沖液，如果洗滌液中的Tween20 超過0.2% ，可使包被于固相上的抗原抗體解吸附而影響實驗的測定下限。洗滌可采用洗板機或手工洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板內(nèi)注液時應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會因洗滌液難以進入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機洗板時，要保證洗板機上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液吸凈，要求洗板后殘液小于2 μL，即人工扣板墊紙不濕，浸泡時間超過45 s。

3.4 顯色

大多數(shù)情況下ELISA商品多選用HRP 和堿性磷酸酶（ALP）。HRP可催化的底物為過氧化氫，參加反應(yīng)的顯色供氫體有鄰苯二胺（OPD）、鄰聯(lián)甲苯胺（OT）及四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等。其中OPD 難溶于水，見光易變質(zhì)，使用前配制，反應(yīng)過程須避光且OPD有一定毒性。TMB 的反應(yīng)產(chǎn)物為藍色，目視對比鮮明，其性質(zhì)穩(wěn)定，對人體無毒。若選用各類酸性終止液，則會使藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。TMB作底物時的產(chǎn)物檢測波長為450 nm ，ALP 作為標(biāo)記物，其底物一般采用對硝基苯磷酸酯（pNPP），產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，吸收波長是405 nm。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須要嚴(yán)格按照試劑盒說明書中規(guī)定的溫度和時間操作，不可隨意改變溫度和時間。

3.5 比色

ELISA 顯色結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進行檢測，不可由肉眼判斷結(jié)果，因為不同個體的色覺存在差異，尤其是對于乙型肝炎病毒e抗體、乙型肝炎病毒核心抗體這樣的檢測項目，肉眼難以判斷。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進行測定，包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的2個吸收峰波長，用非敏感波長清除由于容器上的劃痕、指印、背景等造成的干擾。TMB最大吸收波長為450 nm ，非敏感波長為630 nm ，一般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負值的現(xiàn)象。加入終止液后應(yīng)盡快比色，否則樣本吸光度值會逐漸下降，顯色越深下降越快，應(yīng)在2 min 內(nèi)比色。

3.6 應(yīng)加強檢測儀器的質(zhì)量控制

如定量移液器要定期校準(zhǔn)；洗板機要及時傾倒廢液罐，補充洗滌液，開機后運行沖洗程序（雙蒸水），檢查系統(tǒng)液路系統(tǒng)（有無漏水），檢查吸液和注液速度，關(guān)機運行沖洗程序（雙蒸水），清洗吸針及水箱，儀器外觀清潔；酶標(biāo)儀要定期檢查濾光片是否合格，光源是否穩(wěn)定，機械系統(tǒng)是否有故障，保持外觀清潔，并定期請廠家工程師進行保養(yǎng)維修；水浴箱及存放試劑的冰箱要每天監(jiān)測溫度，并有記錄等。

4  結(jié)果的判定

定量測定需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算結(jié)果。

綜上所述，ELISA檢測操作步驟復(fù)雜，可能會影響測定結(jié)果的因素較多，分布在測定操作的各個步驟中，因此必須加強各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果。

 ELISA實驗中必看的ELISA實驗操作要點

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