信帆生物代理銷售ELISPOT試劑盒，解析其原理、步驟和發(fā)展！

在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答(B細(xì)胞免疫)，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(cell mediated immune response，CMI)也是人們所關(guān)注的，而T細(xì)胞在CMI中起關(guān)鍵作用。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時(shí)以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子(CK)或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或CK的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK的水平。 80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)( ELISPOT )。作為一項(xiàng)新型的免疫酶技術(shù)——酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌抗體細(xì)胞(ASC) 或分泌細(xì)胞因子(CK) 細(xì)胞的一項(xiàng)細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌CK細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè)定中，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

Elispot 法源自 ELISA，又突破傳統(tǒng) ELISA 法，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

(1) elisa通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。

(2) ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT 分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率)

由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。

原理

ELISPOT就其原理來說實(shí)在是很簡(jiǎn)單的，從本質(zhì)上說和ELISA的原理是一樣的，理解起來并不難。細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。傳統(tǒng)的ELISA與ELISPOT都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。

ELISPOT全名為enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin)的單株抗體。靜脈血PBMC細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)分離處理后，會(huì)被分配到微孔盤上，再接受適當(dāng)?shù)目乖碳ぃ⑽⒖妆P放置于溫箱中過一夜培養(yǎng)一段時(shí)間。一般而言，記憶型T細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部(在緊靠分泌細(xì)胞的周圍)分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被 PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細(xì)胞被移除并清洗后，被捕獲的細(xì)胞激素可進(jìn)一步使用生物素(Biotin)標(biāo)記的二次抗體來標(biāo)志，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細(xì)胞會(huì)留下染色斑點(diǎn)。

反應(yīng)步驟可大致分為：

(1) 利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被96孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn);

(2) 加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合;

(3) 洗掉細(xì)胞;

(4) 加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過底物的顯色反應(yīng)，一個(gè)細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn)，zui后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)(reader)就可以計(jì)算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。

以上是檢測(cè)分泌細(xì)胞因子細(xì)胞的流程，如果是檢測(cè)分泌特異抗體的細(xì)胞只需把包被特異抗體變?yōu)榘惶禺惪乖纯伞?/p>

ELISPOT技術(shù)的發(fā)展

(1) ELISPOT技術(shù)的過去

ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky 等人在1983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率。從那時(shí)起世界各國(guó)免疫學(xué)者便開始一長(zhǎng)期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競(jìng)賽，每個(gè)團(tuán)隊(duì)都希望能將此一技術(shù)推廣來研究T細(xì)胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由偵測(cè)T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，來定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時(shí)預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。

ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細(xì)胞功能研究。要讓ELISPOT技術(shù)從B細(xì)胞免疫走向T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生的*個(gè)主要問題，便是靈敏度的提升，因?yàn)門細(xì)胞因子較之B細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。這問題直到1996美國(guó)俄亥俄卅Case Western Reserve大學(xué)Paul Lehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用(Forsthuber et al., Science, 1996)，才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點(diǎn)呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜(Panel A)與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)薄膜(Panel B)并行實(shí)驗(yàn)的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過*相同的實(shí)驗(yàn)，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。

第二個(gè)技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實(shí)驗(yàn)分析的幾個(gè)基本假設(shè)缺乏科學(xué)實(shí)證，也使得該技術(shù)在當(dāng)時(shí)并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如;

實(shí)驗(yàn)所得的斑點(diǎn)是抗原特定T細(xì)胞所生物試劑，還是旁觀細(xì)胞受Cytokine刺激的次級(jí)效應(yīng)?

斑點(diǎn)的小或大有何生理意義;如何決定cutoff值?

能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成?

ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍?

如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙?及到什么程度?

(2) ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在

1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世*zui靈敏抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。藉由檢驗(yàn)新鮮分離PBMC細(xì)胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要參數(shù)：抗原特定T細(xì)胞的clone族群大小;和免疫效應(yīng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)路徑Th1/Th2。

多年來經(jīng)過數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個(gè)問題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。目前一般*，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細(xì)胞水平上識(shí)別抗原特定T細(xì)胞，主要針對(duì)經(jīng)由CD4或者CD8細(xì)胞的免疫反應(yīng)。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，ELISPOT Cytokine 斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑點(diǎn)形態(tài)學(xué)與Time Response分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。也因?yàn)槿绱耍珽LISPOT是個(gè)免疫學(xué)上的標(biāo)竿技術(shù)，它可以允許科研人員在幾乎自然生理?xiàng)l件下，觀察細(xì)胞實(shí)際分泌Cytokine的進(jìn)程，進(jìn)而可以得到藥理學(xué)信息，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細(xì)胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制 T細(xì)胞免疫一般可通過兩程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn);使能分泌Cytokine的Precursor T細(xì)胞族群變小，或減少每Precursor T細(xì)胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息。

ELISPOT分析技術(shù)的幾個(gè)特點(diǎn)已經(jīng)讓它在抗原特定T細(xì)胞免疫學(xué)上*。此技術(shù)是當(dāng)世*準(zhǔn)許百萬分之一1:1000,000的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)的 intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對(duì)T細(xì)胞免疫學(xué)研究是必須的，因?yàn)榭乖囟═細(xì)胞一般在機(jī)體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r(jià)，沒有喪失功能。這一點(diǎn)對(duì)研究試驗(yàn)非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的樣本血樣，如果試驗(yàn)牽涉全國(guó)多個(gè)研究試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，樣本血樣可冰存并同時(shí)集中在「中央實(shí)驗(yàn)室」一齊被測(cè)試。同理，一個(gè)血樣或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。

(3) ELISPOT 未來展望

ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國(guó)發(fā)揮它的完整潛能，它讓免疫學(xué)家可以直接洞察活體內(nèi)T細(xì)胞相關(guān)生理學(xué)或病理學(xué)，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖，經(jīng)由這個(gè)技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進(jìn)入一個(gè)器官系統(tǒng)，在那里視察、發(fā)掘，得到全新的智識(shí)。

從各國(guó)文獻(xiàn)可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥樣本接受免疫療程時(shí)的反應(yīng)(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、腫瘤(Nagorsen, 2000)、或自體免疫樣本體內(nèi)的一個(gè)特定的免疫反應(yīng)型式(Pelfrey, 2000)。ELISPOT技術(shù)同時(shí)也在數(shù)個(gè)疫苗效價(jià)評(píng)估人體試驗(yàn)中，被當(dāng)成重要的終結(jié)指針。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測(cè)HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃將是利用ELISPOT技術(shù)對(duì)亞洲國(guó)家從事HIV疫苗研究和研究試驗(yàn)的有關(guān)研究。我們期待未來此一技術(shù)能在我國(guó)免疫學(xué)界得到廣泛地應(yīng)用。